بررسی مولکولی تعدادی از گونهها و جمعیتهای آبزیان اقتصادی کشور (فاز 2 )
مجری : سهراب رضوانی گیل کلائی
شماره ثبت
829/85
وزارت جهاد کشاورزی
سازمان تحقیقات و آموزش کشاورزی
مؤسسه تحقیقات شیلات ایران ـ پژوهشکده اکولوژی دریای خزر
چکیده
جهت اجرای مرحله دوم این پروژه، روابط فایلوژنی گونه هایی از کپور ماهیان (کلمه، کپور، سس، ماش، سیم و ماهی سفید)، گیش ماهی(گیش ریز، سارم، پرستو هندی و حلوا سیاه) و خرچنگ دراز دریایی مورد بررسی قرار گرفته و علاوه بر این، مطالعات مولکولی جمعیت ماهی کلمه دریای خزر و آرتمیای ایران بررسی شده است.
1- بررسی جمعیت آرتمیا ی ایران: تعداد 100-50 نمونه سیست وآرتمیا از منابع مختلف (دریاچه های شور و اینچه برون در استان گلستان، دریاچه نمک و حوض سلطان در استان قم، کویر میغان اراک در استان مرکزی، دریاچه های مهارلو، بختگان و طشک در استان فارس و آبگیر نوغ رفسنجان در استان کرمان) جمع آوری گردید. استخراج DNA به روش فنل – کلروفرم انجام گردید و تجزیه و تحلیل الگوهای هضمی محصول PCR از ژن rRNAs,tANA-val بطول تقریبی 1570 جفت باز با آنالیز RFLP توسط 11 آنزیم محدود اثر انجام گردید. 10 آنزیم از 11 آنزیم ( Alu I, Ava II, Eco47I, Hae III, Hind III , Hinf I , Msp I , Mbo I , Rsa I , Taq I ) الگوی چند شکلی جمعیتی را نشان دادند. در مجموع، 16 هاپلوتیپ در منابع آبی کشورشناسایی و تفاوت های ژنتیکی و روابط فیلوژنیک آنها مشخص گردید. بر اساس آنالیز شبیه سازی با هزار بار تکرار، تفاوت معنی داری بین هاپلوتیپهای مناطق مختلف مشاهده شده است( 005/0 P<).
2- فایلوژنی کپور ماهیان حوضه جنوبی دریای خزر
در این بررسی، 15 نمونه ازباله ماهی سفید ، 10 نمونه سس ماهی بزرگ س،10 نمونه ماهی سیم، 10 نمونه ماهی ماش و 15 نمونه کلمه از مکانهای صید تجاری جمع آوری گردید. واکنش PCR با استفاده از یک جفت پرایمر دارای توالی نوکلئوتیدهای ژن سیتوکروم b ماهی کلمه انجام شد..برای آنالیز RFLPs، محصول PCR ژن سیتوکروم b (bp1117 ) هر یک از نمونه های ماهی با پنج آنزیم محدودالاثر) DNA آز ( در دمای مناسب انکوباسیون هضم گردیدند. پس از تجزیه وتحلیل باندهای ایجاد شده، پنج آنزیمHinf I ، Hinc II،Hha I ، RSa I و Mbo I الگوهای پلی مورفیسم در بین گونه ها نشان دادند که در نتیجه ژنوتیپ های ناشی از هضم آنزیمی از چهار آنزیم Hha I، Hinf I و RSa Iهاپلوتیپ ها AAAA را برای سس بزرگ سر،BBBB را برای کلمه، CCCC را برای سیم و DDDD را برای ماش و EEEE را برای ماهی سفید نشان داده‌اند که هر یک از این هاپلوتیپ ها برای هر یک از این گونهها دارای اهمیت نشانگر ژنتیکی گونه‌ای بوده و برای تمایز این گونهها دارای ارزش می‌باشند.
3- بررسی جمعیت ماهی کلمه دریای خزر: نمونه های ماهی کلمه از دو منطقه بندر انزلی و گرگان (از هر منطقه 70 نمونه) جمع آوری گردید. جهت انجام PCR از توالی ژن سیتوکروم b استفاده شدو آنالیز RFLP با 13 آنزیم اندونوکلئاز انجام شد. 6 آنزیم از 13 آنزیم (Eco47 I, Hae III, Hha I, Hinc II, Hinf I, Mbo I)، دو نوع ژنوتیپ متفاوت را در ماهیان مورد مطالعه نشان دادند. آنالیز شبیه سازی با هزار بار تکرار، تفاوت معنی داری بین هاپلوتیپهای مناطق مختلف نشان نداد. (05/0 P<).
4- فایلوژنی گیش ماهیان خلیج فارس: نمونه های مورد بررسی از 4 گونه گیش ماهیان (گیش ریز،سارم،پرستوهندی وحلوا سفید ) از دو منطقه بندر عباس و خوزستان جمع آوری گردید( از هر گونه 8 نمونه ). جهت انجام PCR از توالی ژن سیتوکروم b استفاده شده (محصولPCR حدود 1100 جفت باز بود) و آنالیز RFLP با 8 آنزیم اندونوکلئاز انجام شد. 3 آنزیم از 8 آنزیم (Alu I, Mbo I, Rsa I ) الگوهای چند شکلی را برای هر یک از گونه ها، بر ژل پلی اکریل آمید نشان داده که در نتیجه آن 4 هاپلوتیپ متفاوت بدست آمد. هاپلوتیپ BAA برای گونه Parastromateus niger، هاپلوتیپ AAB برای Trachinotus mookalee، هاپلوتیپ ABA برای Caranx para و هاپلوتیپ ACA برای Scomberoides commersonianus بوده است.بر اساس آنالیز شبیه سازی با هزار بار تکرار، تفاوت معنی داری بین هاپلوتیپهای مناطق مختلف مشاهده شده است( 05/0 P<)با استفاده از نرم افزار PAUP درخت فایلوژنی گونه های مورد مطالعه رسم گردید.
5- بررسی جمعیت لابستر Panulirus homarus: این تحقیق با استفاده از 240 نمونه از مناطق چابهار، جود، رمین، کنارک، پزم و تنگ انجام شد. در این تحقیق، تنوع ژنتیکی نمونه هائی از شاه میگو دریای عمان Panulirus homarus در آبهای سواحل سیستان و بلوچستان به روشPCR-RFLP مورد بررسی قرار گرفت. نه آنزیم محدود گر برای هضم آنزیمی محصول PCR مورد استفاده قرار گرفت که شش آنزیم الگوی باندی چند ریختی Xap I, MspI, RsaI, HinfI , TaqI و BsmAI وسه آنزیم نیز الگوی باندی تک ریختی را نشان دادند. مطالعات مولکولی، ناهمگنی ژنتیکی را بین مناطق مختلف نمونه برداری نشان نداده و علاوه بر این، مطالعات ریختی نیز با نتایج مولکولی سازگار بود. اگر چه از نظر ریختی بنظر می رسد که نمونه های مورد مطالعه هیبرید بین دو زیر گونه از P. homarus باشند ولی مطالعات مولکولی با استفاده از مقایسه هاپلوتیپها نشان داد که این نمونه ها دارای شباهت بیشتری به زیر گونه P. megasculpta میباشد.
6- بررسی فیلوژنی 5 گونه لابستر ایران: گونه های Punulirus homaruc, P. versicolor , P. polyphagus , Scyllarides squammosus , Thenus orientalis از خرچنگهای دراز دریایی ایران با استفاده از روشهای مولکولی شامل ژن COI با استفاده از روش PCR-RFLP مورد مطالعه قرار گرفت. کلیه کلادوگرامهای حاصل از آنالیز داده های ریختی و مولکولی تک نیائی بودن این گونه ها را تائید نمودند. از میان 15 آنزیم محدود کننده به کار رفته درعملیات هضمآنزیمی، 11 آنزیم RsaI ,PvuI, MspI, MboI , Hinf I , Hinc II, Hae III, Bgl II, Bcl I, Alu I و Taq I، محصول PCR را برش دادند. در میان گونه های مختلف، الگوهای چند شکلی گوناگونی نشان دادند. از این میان آنزیم Bgl II در گونه Panulirus versicolor ، دو برش ودر نتیجه سه باند ایجاد نموده که نظر می رسد بتوان این آنزیم را به عنوان یک Marker مولکولی جهت شناسایی گونه P. versicolor مطرح نمود.
کلمات کلیدی: تنوع ژنتیکی، PCR-RFLP، خانواده کپور ماهیان دریای خزر، خانواده گیش ماهیان خلیج فارس و دریای عمان، ارتمیای ایران، لابستر خلیج فارس و دریای عمان