شناسایی ویروس ایجاد کننده سندرم لکه سفید (WSSV) در میگوی پرورشی سفید هندی در ایران بااستفاده از PCR
مجری :امیر مسعود صابری
شماره ثبت
842/86
وزارت جهاد کشاورزی
سازمان تحقیقات و آموزش کشاورزی
مؤسسه تحقیقات شیلات ایران
چکیده
در این تحقیق نمونه های مشکوک به بیماری و سالم مورد بررسی قرار گرفتند. از آنجائیکه ویروس WSS جزء ویروسهای DNA دار است از نمونه های میگوی آلوده DNA استخراج گردید وژنوم ویروس توسط واکنش PCR ردیابی شد. توالی کامل ژنوم ویروس WSS از اینترنت بدست آمده وبا نرم افزارDNAsis دو جفت پرایمر ازقسمت VP24 ژن ویروس برای Nested PCR طراحی شد. پس ازطراحی این پرایمرها با جستجودربانک ژن و تایید اختصاصی بودن آنها جهت سنتز سفارش داده شد و سنتزگردیدند. همچنین بمنظور حساسیت بیشترروش تشخیص وکنترل واکنش در مراحل کار جفت سوم پرایمر از قسمت VP24ژن ویروس طراحی شد که محصول PCR آنها کوچکتر از پرایمرهای قبلی است.
یک جفت پرایمر نیز برای ژن 18SrRNA میزبان طراحی گردید تا بعنوان House keeping gene همیشه در واکنش PCR نمونه های مثبت و منفی وجودداشته باشد. متعاقب استخراج DNA و بررسی کمی و کیفی آن، واکنش Nested PCR همراه با کنترل انجام گرفت.جمع آوری و ارسال نمونه ها از استانهای خوزستان و بوشهر در چند نوبت انجام گردید. DNA ویروس در مجموع در 23نمونه تکثیرشد و تعداد9نمونه منفی بودند.
به منظور انجام آزمایشهای بعدی و همچنین ارائه روشی که بتوان در همه آزمایشگاهها با اطمینان ویروس فوق را ردیابی نمود، محصول حاصله، ترادف یابی شد وسپس ترادف مذکور در بانک ژن با نرم افزار Nucleotid Blast آزمایش گردید و مشخص شد که ژن تکثیر شده مربوط به ویروس مورد نظر میباشد اما اختلافاتی نیز با سویه های گزارش شده در بانک ژن نیز دارد. ژن مذکور بعنوان ویروس ایران در بانک ژن با شماره Accession DQ196431 ثبت شده است. این ژن با ژنها ی موجود در بانک ژن 97 درصد شباهت دارد. ژن WSV406 هم تعیین ترادف شده و به بانک ژن ارائه گردیده است، این ژن با ژنهای موجوددر بانک ژن 99 درصد شباهت دارد.
محصول PCR درپلاسمید کلون شد وصحت کلونینگ نیز آزمایش و تایید گردیده است. این پلاسمید نو ترکیب نیز بعنوان کنترل داخلی PCR مورد استفاده قرار میگیرد.
واژه های کلیدی:
میگوی سفید هندی، PCR، white spot syndrom virus(WSSV)،Penaeus indicus