اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق:
در تکثیر مصنوعی ماهیان خاویاری، جنیست و همچنین مرحله رسیدگی جنسی دارای اهمیت زیادی می باشد. در حال حاضر به دلیل عدم وجود تفاوتهای مورفولوژیک میان ماهیان نر و ماده در مراحل مختلف رسیدگی جنسی، تشخیص جنسیت مولدین با مشکلاتی همراه است. بطوریکه گاهی ماهیان ماده نارس که رسیدگی آنها به درستی تشخیص داده نمی شود، بجای مولد نر وارد کارگاههای تکثیر شده و در برنامه ریزی تکثیر مصنوعی اخلال ایجاد می نماید (Moghim, 1999). جهت تولید خاویار پرورشی و افزایش بهره اقتصادی، این امر مستلزم جداسازی ماهیان نر و ماده قبل از رسیدن به سن بلوغ و ایجاد جمعیتهای تمام ماده می باشد. امروزه تشخیص جنسیت ماهیان خاویاری با استفاده از روش تکه برداری از گنادها (Bahmani & Kazemi, 1998; Ferreiro, Medrano, & Gall, 1989) و انجام مطالعات بافت شناختی (A. Van Eenennaam, Murray, & Medrano, 1999) و اندازه گیری سطوح هورمونی (Billard & Lecointre, 2000) امکانپذیر است که استفاده از این روشها علاوه بر وقت گیر بودن می تواند استرس زا بوده و نیز مخاطراتی را برای ماهی مورد نظر به همراه داشته باشد. علاوه بر این استفاده از روش بافت شناسی در تشخیص جنسیت ماهیان خاویاری تنها زمانی امکانپذیر است که ماهیان موردنظر حداقل چهار ساله (Ferreiro et.al.,1989) و در ماهیان پرورسی یکساله باشند (Bahmani & Kazemi, 1998).
شناسایی مارکرهای مولکولی وابسته به جنس در ماهیان دارای اهمیت زیادی در تحقیقات کاربردی و پایه ای است. بطوریکه با استفاده از مارکرهای مولکولی، تشخیص دقیق جنسیت در مراحل اولیه زندگی تاسماهیان و برنامه ریزی جهت دستیابی به محصول با ارزش اقتصادی از جمله خاویار امکانپذیر میگردد. تاکنون کروموزوم های جنسی در تاسماهیان شناسایی نشده است (A. L. Van Eenennaam, 1997). اگرچه مطالعات انجام شده با استفاده از مادههای ژاینوژنزی، وجود سیستم تعیین جنسیت هتروگامتی ماده (WZ/ZZ) را در تاسماهیان ثابت نموده است (Flynn, Matsuoka, Reith, Martin-Robichaud, & Benfey, 2006; Omoto, Maebayashi, Adachi, Arai, & Yamauchi, 2005; A. Van Eenennaam, et al., 1999). با این وجود مطالعات انجام شده بمنظور دستیابی به مارکرهای وابسته به جنس در DNA ژنومی با استفاده از روشهای AFLP و RAPD نتایج رضایت بخشی را در برنداشت(Keyvanshokooh & Gharaei, 2010; Keyvanshokooh, Pourkazemi, & Kalbassi, 2007; Wuertz, et al., 2006; Yarmohammadi, Pourkazemi, Ghasemi, Hassanzadeh, & Chakmehdouz, 2012). بر اساس نتایج حاصل از مطالعات انجام شده، بنظر میرسد که روشهای مبتنی بر DNA ژنومی دارای حساسیت لازم جهت آشکارسازی ژنهای شرکت کننده در تعیین جنسیت و مراحل مختلف تمایز گنادی را دارا نمی باشند و بدینمنظور استفاده از تکنیکهای بیان ژن که دارای دقت بالاتر و حساسیت بیشتری میباشند، پیشنهاد میگردد. بطوریکه نتایج تحقیقات انجام شده در تاسماهی سیبری نقش بعضی از ژنها را در تمایز گنادی جنس نر گزارش نموده است (Berbejillo, Martinez-Bengochea, Bedó, & Vizziano-Cantonnet, 2012; Berbejillo, Martinez Bengochea, et al., 2012) تاکنون توالی برخی از ژنهای موثر در تمایز و توسعه گنادی در برخی از گونههای تاسماهیان از جمله توالی نسبی sox9 در تاسماهی سیبری (EU241882.1) و تاسماهی اروپایی (AY788912.1)، توالی نسبیdmrt1 در تاسماهی سیبری (HQ110106.1) و سفید (AY057061.1)، توالی نسبی foxl2 در تاسماهی روسی (JX421755.1) و سیبری (JN182652.1) شناسایی و در بانک ژن به ثبت رسیده است. توالی ژن های cyp19a1 و cyp11b1 در مورد تاسماهیان شناسایی نشده است. بنابراین در این تحقیق ابتدا توالی ژن های مذکور در فیلماهی مورد شناسایی و ارزیابی قرار خواهد گرفت و سپس بیان اختصاصی ژنهای دخیل در تمایز جنسی گناد از جمله foxl2 ، dmrt1، Sox9 و تولید آنزیم های استروئیدزا شامل cyp17a1 و cyp19a1a ، در طول مراحل مختلف توسعه گنادی (شامل مراحل تمایز نیافته، آغاز تمایز جنسی، تمایز یافته و مرحله بلوغ جنسی) در فیل ماهی پرورشی نر و ماده مورد بررسی قرار خواهد گرفت. برای این منظور بیان ژنهای مورد نظر با استفاده از روش qPCR (Real-Time quantitative-PCR) مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
نتایج:
در تحقیق حاضر توالی نسبی ژن های sox9، dmrt1، foxl2 بعنوان عامل رونویسی در تعیین و تمایزجنسیت مهره داران و cyp19a1aو cyp17a یعنوان ژن های کد کننده آنزیم های آروماتاز که در تعیین و تمایز جنسیت در مهره داران نقش دارند و همچنین ژن Ar بعنوان گیرنده آندروژن در فیل ماهی پرورشی برای اولین مورد شناسایی قرار گرفت و در بانک ژن به ترتیب با کدهای شناسایی (KM280567، KM280568 ، KM280569، KM280570، KM280571) ثبت شد. مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن های مذکور در فیل ماهی با سایر گونههای ماهیان خاویاری نشان دهنده تشابه قابل توجه بین آنهاست. همچنین مقایسههای دیگر نشان دهنده شباهت نسبی در بین شاخههای مختلف جانوری می باشد که می تواند دلیلی بر نقش حفاظت شده dmrt1 در مهره داران باشد.
نتایج این تحقیق نشان داد که در میان 4 ژن کاندید وابسته به جنس نر (sox9، dmrt1، cyp17a1 و ar) که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفتند، همه ژن ها بیان دو شکلی جنسی را در نرها در مراحل مختلف رسیدگی جنسی نشان دادند. در میان این 4 ژن، فقط cyp17a1 در گناد فیل ماهیان نر در مرحله 1 رسیدگی جنسی ( نارس) بیان شد. Dmrt1 الگوی بیانی دوشکلی جنسی در گناد های نر در مراحل رسیدگی جنسی 2، 3 و 4 را نشان داد. اگرچه، sox9 و ar بیان دو شکلی جنسی را فقط در گنادهای نر مرحله 4 نشان دادند.
همچنین مطالعه بیان ژن های مرتبط با رسیدگی جنسی در جنس ماده فیل ماهیان مورد مطالعه نشان داد که بیان ژن های foxl2 و cyp19a1a دارای نقش مهمی در کنترل فرآیند تکامل گناد جنس ماده ایفا می نمایند. با در نظر گرفتن الگوی بیان mRNA foxl2 و cyp19a1a ، می توان چنین نتیجه گیری نمود که foxl2 در تنظیم فعالیت cyp19a1a نقش دارد. با توجه به بیان این دو ژن در تخمدان های فیل ماهیان مورد مطالعه می توان بیان نمود که این دو ژن در فرآیند تمایز جنسی فیل ماهیان ماده شرکت می نمایند و در تعیین جنسیت دخیل نیستند.
نتایج به دست آمده از سنجش آندروژن های پلاسما نتایج به دست آمده از این تحقیق را حمایت می کند. نتایج حاصل شده در این تحقیق، پایه ای برای تحقیقات بیشتر در مورد تمایز جنسیت و توسعه استراتژی هایی برای تعیین جنسیت تاسماهیان در آبزی پروری را فراهم خواهد نمود. بمنظور دستیابی به مارکر مولکولی تعیین جنسیت در تاسماهیان، تحقیات بیشتر با استفاده از تکنولوژی های نوین ضرورت دارد.
دستورالعمل فنی و توصیه ترویجی :
با در نظر گرفتن نتایج این تحقیق، بیان cyp17a1 mRNA در مراحل ابتدایی تر تکامل گناد جنس نر آشکار گردید ( مرحله 1 رسیدگی جنسی) و با توجه به بیان دوشکلی جنسی واضح در فیل ماهیان نر، بنظر می رسد که این ژن قابلیت استفاده بعنوان مارکر جنسیت در ماهیان نر تازه تمایز یافته در فیل ماهیان پرورشی را داشته باشد. هرچند جهت استفاده کاربردی از این ژن بعنوان مارکر تعیین جنسیت نیاز به انجام مطالعات تکمیلی بمنظور یافتن SNP های وابسته به جنسیت با استفاده از تکنولوژی های جدید توالی یابی می باشد.
ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :
این یافته ها قابلیت استفاده در مراکز آموزش عالی– دانشگاهی و مراکز تحقیقاتی را دارا می باشد. با توجه به عدم معرفی مارکر ژنتیکی تعیین جنسیت در گونه های مختلف تاسماهیان و انجام مطالعات مولکولی در این زمینه، نیاز به استفاده از تکنیک های جدید و انجام مطالعات تکمیلی بمنظور دستیابی به مارکرهای تعیین جنسیت سریع در تاسماهیان می باشد.