اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق :
از میان گونه‌های پرورشی میگو برخی از گونه‌ها از جمله میگوی سفید غربی (وانامی) به واسطه داشتن برخی از ویژگی‌های منحصر به فرد بطور فزآینده‌ای در سرتاسر جهان گسترده شده است بطوریکه امروزه بیش از 90 درصد تولیدات آبزی پروری را به خود اختصاص داده است. واردات این گونه به کشور برای اولین بار 1383 با هدف ایجاد تنوع گونه‌ای و مقابله با مشکلات ناشی از شیوع بیماری لکه سفید در مزارع پرورشی میگوی کشور صورت پذیرفت. لیکن با توجه به اینکه زیستگاه اصلی این گونه سواحل اقیانوس آرام از جنوب مکزیک تا شمال کلمبیا می‌باشد، دسترسی به جمعیت‌ها مختلف بویژه مولدین وحشی در طی این سال‌ها تقریباً غیر ممکن بوده است و لاروهای تولید شده در مراکز تکثیر میگوی کشور معمولاً از مولدین میگوی سفید غربی پرورش داده شده در شرایط آب و هوایی ایران تأمین شده است. با توجه به اینکه انتخاب‌های صورت گرفته ترجیحاً بر اساس صفات فنوتیپی میگوهای پرورشی بوده این احتمال وجود دارد که این نوع روش انتخاب در نهایت منجر به آمیزش افراد خویشاوند شود که نتیجه آن، افزایش میزان هم خونی و کاهش تنوع ژنتیکی در نتاج تولید شده بوده است. بنابراین نظارت بر روی ساختار ژنتیک مراکز تکثیر بسیار حائز اهمیت می‌باشد و لازمه آن دسترسی به اطلاعات گنجانده شده در DNA افراد است. امروزه می‌توان با استفاده از تکنیک‌های پیشرفتة مولکولی تفاوتهای موجود بین افراد را در سطح مولکولی مشخص نمود. در این بین استفاده از نشانگرهای مولکولی رایجترین ابزار جهت رسیدن به اهداف از پیش تعیین شده است. از مهمترین این نشانگرها، نشانگرهای میتوکندریایی می‌باشند که در مقایسه با نشانگرهای دیگر دارای مزیت‌هایی متعددی از قبیل عدم وقوع نوترکیبی، وراثت مادری، هاپلوئید بودن آنها، نرخ بالای جهش، کوچک بودن آنها و راحتی کار با آنها می‌باشد. نشانگرهای COI و 16SrRNA از مهمترین نشانگرهای پرکاربرد میتوکندریایی می‌باشند که از آنها جهت تعیین روابط فیلوژنی و تفاوتهای ژنتیکی میان افراد مختلف یک گونه استفاده می‌شود. از این رو هدف از اجرای این پروژه موارد زیر می‌باشد:
- تعیین تفاوتهای ژنتیکی نسلهای مختلف میگو
- تعیین فاصله ژنتیکی نسلهای مختلف میگو
- تعیین تعداد هاپلوتیپ‌ها در نسلهای مختلف میگو
- تعیین میزان تنوع هاپلوتیپی در نسلهای مختلف میگو
- تعیین تنوع نوکلئوتیدی در نسلهای مختلف میگو
- تعیین میزان پلی مورفیسم و مونومورفیسم در نسلهای مختلف میگو
در این مطالعه پس از شناسایی جمعیت‌های مختلف میگو بر اساس روش ریزماهواره‌ای در نهایت دو جمعیت مولوکائی و های‌هلث به عنوان مولدین نسل صفر میگوی سفید غربی در نظر گرفته شدند. که پس از آمیزش درون گروهی و بین گروهی میان مولدین نر و ماده دو جمعیت فوق، سه ذخیره مختلف H♂×M♀، M♂×H♀ و H♀×H♂ به عنوان میگوهای نسل اول تولید شدند. شایان ذکر است که میگوهای نسل دوم از آمیزش مولدین ذخیره H♂×M♀ نسل اول بوجود آمدند. بمنظور تعیین تفاوتهای ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگوی سفید غربی عاری از بیماری خاص در این مطالعه از نشانگر میتوکندریایی منطقه 16S rRNA با طول bp 529 استفاده شد. روش کار بدین صورت بود که بعد از استخراج DNA میتوکندریایی نسلهای مختلف میگو و تکثیر قطعه هدف، توالی یابی آن بر اساس Sanger و همکاران (1977) با استفاده از توالی یاب اتوماتیک ABI 377 (Applied Biosystems Inc.) توسط شرکت Seq/Teq/California/USA انجام شد. گفتنی است که تعیین توالی صورت گرفته بصورت یک طرفه بر اساس استفاده از آغازگر معکوس انجام شد. مقایسه اولیه توالیهای حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم افزار آنلاین ClustalW2 انجام شد. در ادامه با استفاده از نرم افزار Nuoclotid Blast مقایسه توالیهای بدست آمده با توالیهای مشابه در سایت NCBI صورت پذیرفت. همردیفی چندگانه کلاستال (ClustalW Multiple Aligment) با استفاده از نرم افزار BioEdite با هدف محاسبه ترکیب بازی توالی‌ها و نسبت جانشینی ترانزیشن به ترانسورژن انجام شد. همچنین بمنظور دستیابی به ماتریکس فاصله ژنتیکی براساس روش Kimura-2-parameter و شرایطی از قبیل حذف کامل Gap یا حذف باز‌های جفت جفت (Pairwise) با در نظر گرفتن جهش‌های ترانزیشن و ترانسورژن، سرعت یکنواخت و الگوی هموژن بین افراد با استفاده از نرم افزار MEGA 7.0 محاسبه شد.
نتایج :
نتایج حاکی از آن بود که از 486 جایگاه شناسایی شده 484 جایگاه بصورت محافظت شده بودند و تعداد جایگاه‌های مونومورف در دامنه 486-482 قرار داشت که شامل 2 جایگاه پلی‌مورف و 2 جایگاه انتقالی بود. این در حالی بود که در بررسی این ناحیه از میتوکندری تنها 2 هاپلوتیپ شناسایی شد که میزان تنوع هاپلوتیپی و تنوع نوکلئوتیدی محاسبه شده به ترتیب 159/0±356/0 و 00147/0 محاسبه شد، که این میزان حاکی از پائین بودن میزان تنوع هاپلوتیپی و نوکلئوتیدی در نسلهای مختلف میگوی سفید غربی بود. همچنین با توجه به شباهت بالای ژنتیکی نسلهای مختلف میگو و کاهش فاصله ژنتیکی میان آنها میزان تمایز ژنتیکی و جریان ژنی بین نسلهای مختلف میگو به ترتیب 142/0- و 00/2- بود که این حالت ممکن است به دلیل کوچک شدن جمعیت مؤثر و رانش ژنتیکی اتفاق افتاده باشد. لذا با توجه به اینکه ژنوم میتوکندری از مادر به فرزندان به ارث می‌رسد، انتظار می رود که میزان تنوع در این ژنوم تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله رانش ژنتیکی به دلیل عدم دسترسی به مولدین جدید قرار گرفته باشد. از این رو مشاهده شد که به دلیل حفاظت بالای ژنوم میتوکندری در منطقه 16S rRNA هیچگونه تمایز ژنتیکی در میان نسلهای مختلف میگوی عاری از بیماری خاص وجود ندارد.
دستور العمل فنی و توصیه ترویجی :
با توجه به نتایح بدست آمده از این مطالعه و سایر مطالعات صورت گرفته در این خصوص اینگونه می‌توان عنوان نمود که ژنوم 16S rRNA میتوکندریایی استفاده شده در این مطالعه در مقایسه با سایر نشانگرهای میتوکندریایی از قبیل منطقه COI و d-loop به دلیل وجود مناطق حافظت شده در این منطقه از ژنوم و کوچک بودن طول این ناحیه از سرعت تکاملی پائین تری برخوردار می‌باشد. از این رو ژنوم این منطقه قادر نیست که تفاوتهای ژنتیکی میان نسلهای مختلف یک گونه را نشان دهد. لیکن تنها کاربرد این نشانگر تعیین روابط فیلوژنتیک میان گونه‌های مختلف میگوهای خانواده پنائیده با همدیگر یا با سایر موجودات است. بنابراین با توجه به وجود مناطق محافظت شده کمتر در سایر مناطق ژنوم میتوکندریایی همانند منظقه COI و d-loop توصیه می‌گردد که جهت تعیین تفاوتهای ژنتیکی میان نسلهای مختلف میگو بصورت درون گونه‌ای از ژنوم‌های فوق استفاده گردد و یا اینکه از روش میکروستلایت جهت تعیین تفاوتهای ژنتیکی، تنوع ژنتیکی و هتروزیگوسیتی در نسلهای مختلف استفاده گردد.
ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :
این دستورالعمل میتواند در کلیه مراکز تکثیر و پرورش میگوی کشور که قصد مولد سازی و تکثیر میگو را از طریق پیش مولدین پرورشی در داخل کشور دارند بکار برده شود. تا از این طریق با شناسایی جمعیت‌های مختلف میگو در هر یک از مراکز تکثیر و شناسنامه دار کردن آنها از آمیزش‌های خویشاوندی میان افراد یک خانواده و جمعیت جلوگیری به عمل آید.