اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق :
امروزه با توجه به افزایش تقاضا برای پرورش لاروهای تولید شده در مراکز تکثیر میگوی در شرایط کنترل شده، انتخاب مولدین در مراکز تکثیر برای دستیابی به نسل‌هایی با معیارهایی از قبیل تولید بهتر و مقاومت در برابر بیماری بر اساس صفات فنوتیپی صورت می‌گیرد که در اکثر موارد این نوع از انتخاب منجر به افزایش جفت گیری میان موجودات خویشاوند شده و در نهایت افزایش همخونی همراه با کاهش شاخص‌های ژنتیکی در زاده‌ها با کاهش میزان بازماندگی، رشد و تولید مثل همراه خواهد بود. از این رو نظارت بر روی ساختار ژنتیک مراکز تکثیر بسیار حائز اهمیت می‌باشد. لیکن اجرای برنامه های اصلاح نژادی و مدیریت منابع شیلاتی نیازمند داشتن اطلاعات دقیق از ساختار ژنتیکی جمعیت‌های میگو و تنوع ژنتیکی مرتبط با آنها است. استفاده از تکنیک‌های پیشرفتة مولکولی امروزه توانسته تفاوت بین افراد را در سطح مولکول DNA مشخص نمایند. از جمله روش‌های موجود استفاده از نشانگرها و جایگاه‌های موجود در ژنوم میتوکندری می‌باشد که به عنوان ابزارهای ژنتیکی کارآمدی برای تعیین هویت حیوانات اهلی و غیراهلی همچنین مشخص نمودن والدین و روابط ژنتیکی بین آنها بکار برده می‌شوند. منطقه کنترلی d-loop به عنوان یک نشانگر‌های میتوکندریایی بسیار پرکاربرد به حساب می‌‌اید، این منطقه فاقد هر گونه ژن رمز کننده‌ای بوده که وقوع هر نوع جهش میتواند در آنجا تثبیت شود بطوریکه میزان جهش نوکلئوتیدها در این منطقه حدود 92برابر DNA هسته‌ای است. لذا میزان بالای جهش و وجود تفاوت در افراد مختلف در این ناحیه سبب شده تا توالی‌یابی بخش‌های مختلف این ناحیه از ژنوم میتوکندری جهت تعیین تنوع ژنتیکی و شناسایی منشاء نژادهای مختلف مورد توجه قرار گیرد. از این رو استفاده از این نشانگر امروزه به عنوان یک ابزار مفید جهت تعیین روابط فیلوژنتیک میان موجودات، تعیین پیوستگی جمعیت‌ها و تکامل موجودات و آنالیز فیلوژنتیکی بمنظور شناسایی روابط خویشاوندی میان افراد یک گونه مطرح است. بنابراین مطالعه بر روی ویژگی های ژنتیکی جمعیت‌های مختلف یک گونه از میگو و تجزیه و تحلیل ارتباطات ژنتیکی بین مولدین با استفاده از نشانگر های میتوکندریایی می تواند از ضروریات مدیریت شناسایی ژنتیکی و افتراق های ژنتیکی افراد جمعیت‌های مختلف در برنامه های تکثیر و پرورش باشد.
از مهمترین اهداف این پروژه
- تعیین شباهت ژنتیکی و رابطه خویشاوندی میان نسل‌های مختلف میگو
- تعیین میزان فاصله ژنتیکی در نسل‌های مختلف میگو
- تعیین تعداد هاپلوتیپ‌ها در نسل‌های مختلف میگو
- تعیین میزان تنوع هاپلوتیپی در نسل‌های مختلف میگو
- تعیین تنوع نوکلئوتیدی در نسل‌های مختلف میگو
- تعیین میزان پلی مورفیسم و مونومورفیسم در نسل‌های مختلف میگو
در این مطالعه دو جمعیت مولوکائی و های‌هلث به عنوان مولدین نسل صفر میگوی سفید غربی در نظر گرفته شدند. که پس از آمیزش درون گروهی و بین گروهی میان مولدین نر و ماده دو جمعیت فوق، سه ذخیره مختلف H♂×M♀، M♂×H♀ و H♀×H♂ به عنوان میگوهای نسل اول تولید شدند و در نهایت میگوهای نسل دوم از آمیزش مولدین ذخیره H♂×M♀ نسل اول بوجود آمدند. بمنظور بررسی رابطه خویشاوندی میان نسل‌های مختلف میگوی سفید غربی عاری از بیماری خاص در این مطالعه از نشانگر منطقه کنترلی d-loop میتوکندریایی با طول bp 1451 استفاده شد. لذا بعد از استخراج DNA میتوکندریایی نسل‌های مختلف میگو و تکثیر قطعه هدف، توالی یابی آن بر اساس Sanger و همکاران (1977) با استفاده از توالی یاب اتوماتیک ABI 377 (Applied Biosystems Inc.) توسط شرکت Seq/Teq/California/USA انجام شد. شایان ذکر است که تعیین توالی نمونه‌های مربوط به قطعه d-loop، DNA میتوکندریال بصورت اختصاصی از دو طرف بر اساس استفاده از آغازگرهای پیشرو و معکوس انجام شد. مقایسه اولیه توالیهای حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم افزار آنلاین ClustalW2 انجام شد. در ادامه با استفاده از نرم افزار Nuoclotid Blast مقایسه توالیهای بدست آمده با توالیهای مشابه در سایت NCBI صورت پذیرفت. همردیفی چندگانه کلاستال (ClustalW Multiple Aligment) با استفاده از نرم افزار BioEdite با هدف محاسبه ترکیب بازی توالی‌ها و نسبت جانشینی ترانزیشن به ترانسورژن انجام شد. بمنظور دستیابی به ماتریکس فاصله ژنتیکی براساس روش Kimura-2-parameter و شرایطی از قبیل حذف کامل Gap یا حذف باز‌های جفت جفت (Pairwise) با در نظر گرفتن جهش‌های ترانزیشن و ترانسورژن، سرعت یکنواخت و الگوی هموژن بین افراد با استفاده از نرم افزار MEGA 7.0 محاسبه شد.
نتایج :
بررسی رابطه خویشاوندی میان نسل‌های مختلف میگو براساس نشانگر منطقه کنترلی d-loop ژنوم میتوکندریال نشان داد که از 997 جایگاه شناسایی شده در هر یک از نسل‌های مختلف میگو تعداد 6 هاپلوتیپ‌ها و 799-766 جایگاه‌های مونومورف وجود دارد. با وجود اینکه میزان تنوع هاپلوتیپی و تنوع نوکلئوتیدی برای کل نسل‌های مختلف میگوی عاری از بیماری خاص به ترتیب 877/0 و 12/0 درصد بود. لیکن نتایج نشان داد که میزان هموزیگوسیتی از نسلی به نسل دیگر در حال افزایش است و فاصله ژنتیکی اندکی میان نسل‌های مختلف میگوی عاری از بیماری خاص مشاهده شد. لذا با توجه به نتایج بدست آمده اینگونه می‌توان عنوان نمود که عدم ورود ذخیره جدید به مجموعه SPF و آمیزش‌های صورت گرفته میان مولدین نر و ماده خویشاوند، به دلیل کوچک شدن جمعیت مؤثر و رانش ژنتیکی ایجاد شده تعداد هاپلوتیپ‌ها از نسل صفر به نسل دوم به تدریج کاهش یافته است. از این رو به دلیل رابطه خویشاوندی بالای میان نسل‌های مختلف میگو در بررسی منظقه d-loop ژنوم میتوکندری اختلاف ژنتیکی کمی میان آنها مشاهده شد.
دستور العمل فنی و توصیه ترویجی :
از آنجا که میگوی سفید غربی (وانامی) در کشور به عنوان یک گونه غیر بومی بوده، دسترسی به جمعیت‌های مختلف این گونه بسیار محدود می‌باشد. لذا با توجه به استفاده از مولدین پرروشی در داخل کشور می‌بایست شاخص های ژنتیکی ذخائر مختلف مولد مراکز تکثیر مورد بررسی قرار گیرد تا از این طریق با شناسنامه دار کردن آنها از آمیزش‌های خویشاوندی که در نهایت منجر به افزایش ضریب هم خونی و ایجاد صفات نامطلوب فنوتیپی می‌شود جلوگیری به عمل آید. از سوی دیگر با توجه به نتایج بدست آمده می‌توان عنوان نمود که استفاده از قطعه d-loop ژنوم میتوکندریایی میگوهای سفید غربی، قادر به نشان دادن روابط خویشاوندی میان نسل‌های مختلف میگو نمی‌باشد، لیکن با توجه به اینکه این منظقه در میتوکندری میگوها فاقد هر گونه ژن رمز کننده‌ای می‌باشد، بنابراین وقوع هر گونه جهش میتواند در آنجا تثبیت شود. از این رو با توجه به توالیهای بدست آمده و جایگاه‌های متغییر مشاهده شده در این مطالعه توصیه می‌گردد که از این قطعه بیشتر جهت تعیین تفاوت‌های ژنتیکی میان نسل‌های مختلف میگو استفاده گردد. همچنین پیشنهاد می‌گردد محققان گرامی در مطالعات آینده جهت تعیین روابط خویشاوندی میان نسل‌های مختلف میگو بجای استفاده از نشانگر‌های میتوکندریایی از روش نوین چندریختی تک نوکلئوتیدی استفاده نمایند.
ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی :
می‌توان با تدوین یک دستورالعمل فنی و ارائه آن به ادارات کل شیلات و دامپزشکی استان‌ها همراه با انجام اقدامات کاربردی بویژه در مراکزی که قصد مولد سازی و تکثیر میگو را دارند با شناسایی جمعیت‌های مختلف میگو ثیر و شناسنامه دار کردن آنها از آمیزش‌های خویشاوندی میان افراد خویشاوند جلوگیری به عمل آورد.