اهمیت، ضرورت، اهداف و روش تحقیق:
امروزه نشاندار کردن موجودات زنده با مارکرهای ژنتیکی درزمینه های مختلف علوم زیستی کاربردهای فراوانی دارد . بااین تکنیک میتوان بانشاندارکردن بچه ماهیان مطالعاتی ازقبیل ردیابی وتعیین مسیرهای مهاجرت آنها ،تعیین ضریب بازگشت ماهیان، مطالعات بیولوژیکی و زیست محیطی، تشخیص بیماریها ، کشف داروهای جدید و .... را انجام داد. تولید نوردرموجودات ازجمله صفاتی میباشد که درمطالعات بیولوژیکی کاربرد وسیعی دارد .بااستخراج ژن عامل پروتئین تولید کننده نور وکلون نمودن آن در تخم ماهی میتوان این صفت رابه ماهی منتقل و با تولید نورسبز رنگ ایجاد شده ، آنها راشناسایی و ردیابی نمود. از اهداف مهم اجرا این پروژه کلون سازی ژن های رمز کننده زیر واحد های α و β آنزیم لوسی فراز در سیستم یوکاریوتی، ایجاد سازه های ژنتیکی بیانی مناسب جهت بیان ژنهای luxA و luxB بصورت همزمان در سلول های یوکاریوتی و برسی امکان کلون کردن ژن لوسیفرازدر تخم ماهی سفید و کپور می باشد.
نتایج:
برای اجرای این پروزه جهت دستیابی به ژن لوسیفراز از باکتری ویبریوفیشری استفاده گردیدDNA ژنومی باکتری به روش فنل – کلروفرم استخراج شد. جهت تکثیر ژن های LuxA و LuxB از پرایمرهای اختصاصی که جایگاه های هضم آنزیمی KpnI و BamHI درسمت '5 آن تعبیه شده بوده ، استفاده گردید. محصول PcR پس ازخالص سازی درپلاسمید PT257R کلون گردید و سپس به سلولهای Ecoli منتقل شد. تائید کلون های نوترکیب به روش PCR بارایمرهای اختصاصی و هضم آنزیمی انجام گرفت. قطعات LuxA و LuxB بترتیب در وکتور بیانی PcDNA3.1\hug و PcDNA3.1\neo کلون شد. پلاسمیدهای نوترکیب PcDNA3.1\hug و PcDNA3.1\neo به سلولهای یوکاریوتی NIH3T3 منتقل شدند. جهت بررسی توانایی نورزائی سازه های ژنتیکی تهیه شده، از کشت سلولهای NIH3T3 در حضور دکانال (بعنوان سوبسترا ) و غلظت های مختلف آنتی بیوتیک نئومایسین وهیگرومایسین استفاده شد. نتایج نشان داد که پس ازگذشت 2 ساعت ازاضافه شدن سوبسترا، واکنش نورزائی آغاز می شود و بتدریج با رسیدن به زمان 6 ساعت، میزان نورزائی افزایش قابل ملاحظه ای می یابد. علاوه برموارد فوق جهت تائید بیان و تولید پروتئین لوسی فراز، از روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده شد که ایجاد باند پروتئین 76کیلو دالتونی، موید صحت آزمایشات می باشد.
دستورالعمل فنی و توصیه ترویجی:
با توجه باینکه یکی از مهمترین مباحث بیوتکنولوژی، مهندسی ژنتیک و دستکاری های ژنتیکی برای دستیابی به صفات برتر می باشد، ضروری است این نحقیق با امکانات بیشتر و تامین اعتبار لازم بصورت کامل و تا حصول نتیجه نهائی انجام گیرد.
ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی:
تمامی منابع آبی کشور