چکیده
سلولهای زایا(جنسی) اولیه پیش سازهای جنینی گامت‌ها هستند که از نیمکره گیاهی سلول تخم منشاء گرفته و به ستیغ‌های تناسلی در حال نمو مهاجرت می‌کنند. در ماهیان خاویاریPGC ها بعد از مرحله‌ی 22 سلولی روی توده زرده و در امتداد محور گناد به ستیغ‌های تناسلی مهاجرت می‌کنند و به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در جنس نر و اووگونی در جنس ماده تبدیل می‌شوند. در این مطالعه تخم‌های بارور شده فیل ماهی در مرحله 4-1 سلولی جداسازی شده و تزریقFluorescein isothiocyanate-Dextran با وزن مولکولی 500 به قطب گیاهی جنین‌ها برای ردیابی سلولهای زایا انجام گرفت. مکان‌های دارای بیشترین تجمع سلولهای زایا در آن با میکروسکپ فلوئورسنت مشخص گردید. سپس سلولهای زایای اولیه به روش هضم آنزیمی از لارو ماهیان خاویاری گونه فیل ماهی(قبل و بعد از جذب کیسه زرده ) با استفاده از آنزیم‌های تریپسین (5/0 درصد) و کلاژناز (mg/ml 1) جدا سازی شد و در داخل محیط کشتDMEM و یا L-15 برای سه هفته کشت داده شدند. برای اثبات حضورPGC ها، mRNA از سلولهای کشت داده شده جدا و بیان ژن‌های Nanos و Vasa با استفاده از تکنیک Real-Time طی گذشت سه هفته از کشت مورد بررسی قرار گرفت. کشت سلولهای بنیادی استخراج شده از لاروهای هر دو گروه نشان داد تعداد و قطر کلونی‌ها در گروه بعد از جذب کیسه زرده در هر دو محیط L15 و DMEMافزایش می‌یابد. بنابراین گروه لاروهای بعد از جذب کیسه زرده بعد از استخراج و کشت، سلولهای زایای بیشتری به شکل کلونی تولید می‌کنند. نتایج ایمنوسیتوشیمی نشان دهنده بیان مثبت vasa در سیتوپلاسم سلولهای زایا به عنوان یک نشانگر تشخیصی بود. این امر حضور و تکثیر سلول های بنیادی زایای لارو فیل ماهی در محیط L15 در شرایط in vitro را تایید می کند. از طرفی در این مطالعه بیان مثبت Brdu در DNA سلولهای زایا نیز مشاهده شد. آنتی بادی Brdu به طور انتخابی به DNA سلولها در فاز S چرخه سلولی متصل می شوند. این امر نشان می دهد که سلولهای بنیادی زایا در مقایسه با سلولهای حمایت کننده، قدرت تکثیر بیشتری داشته و زاده هایشان دائما در فاز s چرخه سلولی و در حال رونوشت برداری از DNA هستند. نتایج بیان mRAN ژن هایvasa و nanos در سلولهای زایا استخراج شده از لارو فیل ماهی نشان داد بیان هر دو ژن در دو محیط کشت DMEM و L-15 با گذشت زمان روند صعودی داشت. از نظر آماری اختلاف معنی داری در بیان این دو ژن در روز‌های انتهایی کشت بین دو محیط مشاهده نشد (P > 0/05). برای نگهداری طولانی مدت سلولهای زایا، انجماد با استفاده از دو محافظ سرمایی دی‌متیل سولفوکسید و اتیلن گلیکول انجام گرفت. نتایج نشان داد در حضور DMSO زنده مانی سلولها پس از ذوب نسبت به اتیلن گلیکول افزایش قابل ملاحظه‌ای می‌یابد. با در نظر گرفتن چرخه تولیدمثلی طولانی این جانداران، می‌توان با کشت و تکثیر موفق این سلولها از آن‌ها برای پیوند به داخل گناد گونه‌های دارای دوره تولیدمثلی کوتاه استفاده کرد.