چکیده
بهره برداری از فراورده های پروبیوتیک نقشی کلیدی در حفظ تعادل و پایداری اکوسیستم آبزی پروری و افزایش مقیاس تولید ایفا می نماید. هدف از اجرای طرح حاضر طراحی فرمولاسیون‌هایی از فراورده پروبیوتیک مشتمل بر کنسرسیوم میکروارگانیسم های بومی واجد عملکردهای مفید برای میگوی پرورشی بود. بدین منظور وضعیت سلامت و توانمندی اکوسیستم در 10 سایت پرورش میگوی استان هرمزگان بر اساس تحلیل فراوانی باکتریها، الگوی تنوع زیستی و مطالعات فیلوژنتیک ارزیابی گردید. الگوی تنوع زیستی باکتریها مبتنی بر آنالیز ژن 16S rRNA با استفاده از روشPCR-RFLP انجام شد. الگوی تجمیعی تنوع زیستی باکتریها در نمونه روده میگو بیانگر حضور غالب جنس های Vibrio، Bacillus و Photobacterium با بترتیب 38/33 ، 59/11 و 8/7 درصد بود. در حالیکه در آب استخر جنس های Vibrio، Marinomonas و Photobacterium با بترتیب 59/28 ،96/19 و 79/10 درصد تنوع غالب را تشکیل دادند. همچنین این الگو در رسوبات فراوانی غالب جنس های Bacillus،Vibrio وStreptomyces به میزان بترتیب 16/25، 19/16 و 15درصد را نشان داد. ارتباط تکاملی نزدیک سویه های جداشده از برخی استخرها با سویه های بیماریزا با استفاده از آنالیز فیلوژنتیک بیانگر ریسک بالا و وضعیت دیسبیوز در استخر و در نتیجه حذف آن استخر از برنامه جداسازی پروبیوتیک گردید. نتیجه غربالگری‌های متابولیک و ژنتیک 300 سویه متمایز از میان 1800 جدایه بدست آمده نشان داد 55 سویه دارای فعالیت ضد میکروبی در مقابل 4 گونه باکتری و 2 گونه قارچ بیماریزا بودند. فعالیت ضد باکتری سویه‌ها در محدوده MIC µg/ml 19 تا 625 و فعالیت ضد قارچی آنها در محدودهMFC µg/ml78 تا1250 متغیر بود. غربالگری ژنتیکی مسیرهای بیوسنتز ترکیبات ضد میکروبی نشان داد 22 سویه واجد ژن PKS-1 ، 19 سویه واجد ژن PKS-2 و 23 سویه واجد ژن NRPS بودند. سنجش توانمندی سویه‌ها درمهار رادیکالهای آزاد DPPH نشان داد 45 سویه دارای فعالیت آنتی اکسیدانی در محدوده µg/ml 53/18 تا 1/830 متغیر بودند. غربالگری فعالیت آنزیمی سویه‌ها منتج به شناسایی 36 سویه معادل 61/11 درصد کل سویه ها مولد آنزیم آمیلاز گردید. غربالگری ژن های مولد آمیلاز نشان داد بترتیب 19، 17، 3 و 2 سویه واجد ژنهای amyA، amyP، amy 63 و amySTU بودند. همچنین 35 سویه معادل 29/11 درصد سویه های مورد بررسی مولد پروتئاز بودند. حضور ژنهای مولد پروتئاز aprEو sprA بترتیب در 13 و 2 سویه ردیابی شدند. غربالگری فعالیت آنزیم لیپاز نشان داد 18 سویه معادل 80/5 درصد مولد این آنزیم بودند. در نتیجه غربالگری های متابولیک 35 سویه توانمند انتخاب و ایمنی زیستی آنها در مقابل طیفی از ارگانیسم های جانوری و گیاهی مرتبط با اکوسیستم آبزی پروری و رده سلولی طبیعی انسان ارزیابی گردید. همچنین توانایی همولیز، تولید لسیتیناز و حضور ژنهای شاخص بیماریزایی در این سویه ها بررسی شد. نتایج ارزیابی مرحله ای ایمنی زیستی منجر به حذف 4 سویه بدلیل سمیت در مقابل آرتمیا، 3 سویه بدلیل سمیت در مقابل میکروجلبک های مفید، 7 سویه بدلیل سمیت بر لارو میگو، 6 سویه بدلیل سمیت علیه سلول بندناف انسان، 2 سویه بدلیل تولید لسیتیناز و 1 سویه بدلیل وجود ژنهای بیماریزایی گردید. در مرحله بعدی این پروژه مطالعات دینامیک جمعیت 12 سویه توانمند باقیمانده نشان داد 9 سویه دارای روابط سینرژیستی متقابل بودند و 3 سویه بدلیل تولید ترکیبات ضد میکروبی وسیع الطیف، حساسیت به فعالیت سایر سویه ها و فقدان میانکنش از طراحی فرمولاسیون کنسرسیوم حذف شدند. رابطه سینرژیستی متقابل 9 سویه توانمند بر کینتیک رشد یکدیگر در محیط مایع تایید شد. همچنین میانکنش سینرژیستی متابولیت های تولید شده توسط سویه های توانمند در افزایش فعالیت های ضد میکروبی و آنتی اکسیدانی ثبت شد. نتایج سنجش میزان سیدروفور و قابلیت جذب آهن این سویه ها نشان داد واحد تولید سیدروفور از 51 درصد توسط سویه NT 12 تا 33/87 درصد توسط سویه B 1083 متغیر بود. سویه‌های مذکور قادر به تحمل و بازماندگی بیش از 50 درصد در غلظت های 1 تا 4 درصد نمک های صفراوی و pH های 2 تا 5 بودند. متابولیت های استخراج شده از این سویه ها با استفاده از روش های کروماتوگرافی لایه نازک، ستونی، مایع با کارایی بالا (HPLC) خالص سازی شدند. غربالگری شیمیایی بیانگر ماهیت پلی کتایدی متابولیت های فعال سویه های NT 8، H 303، H 386و NT 12، ماهیت فنولی متابولیت های فعال سویه های NT 107 وB 1083، ماهیت پپتیدی متابولیت های فعال سویه های NT 73، H 331 و NT 72 و ماهیت ماکرولیدی متابولیت های فعال سویه ST 85 بود. تعیین ساختار ترکیب فعال سویه ST85 بر اساس نتایج مطالعات اسپکتروسکوپی نشان داد این ترکیب یک ماکرولید نیتروژن دار با جرم ملکولی 489 گرم بر مول بود. بر اساس جمع بندی توانمندی های متابولیک، ویژگیهای ژنتیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک بدست آمده از 9 سویه پروبیوتیک 8 فرمولاسیون مختلف کنسرسیوم طراحی شد. این فرمولاسیون با بکارگیری سویه های B. velezensis strain NT 8، B. subtilis strain NT 73، B. safensis strain H 303، B. velezensis strain H 331 به عنوان هسته کنسرسیوم و آرایه های مختلف Alteromonas macleodii strain ST 85، Pseudomonas stutzeri strain NT 10، Psychrobacter celer strain NT 72، Aeromonas media strain B 1083 و Virgibacillus salarius strain NT 12 طراحی شدند. ارزیابی تاثیر فرمولاسیون های کنسرسیوم تولید شده بر الگوی تنوع زیستی باکتریهای روده میگو با استفاده از روش PCR-RFLP نشان داد فرمولاسیون های 3، 4 و 5 بیشترین تاثیر را در کاهش فراوانی باکتریهای بیماریزای فرصت طلب بویژه Vibrio را در میکروبیوتای روده میگو نشان دادند. فرمولاسیون های طراحی شده جهت ادامه مطالعات درون تنی در 4 پروژه دیگر مورد ارزیابی قرار گرفتند. در یک پروژه اثرات بازدارنده 8 فرمولاسیون مختلف از کنسرسیوم پروبیوتیک مرکب از 6 تیمار تجویز شده از طریق جیره غذایی و 2 تیمار تجویز شده از طریق آب با روش سنجش مرگ و میر تجمعی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد فرمولاسیون های شماره 5 و 4 در مواجهه با باکتریهای بیماریزای V. harveyi بترتیب با میانگین 33/53 و 67/51 درصد و در مواجهه با V. parahaemolyticus بترتیب 33/48 و 40 درصد نسبت به تیمار کنترل بقاء لاروهای مورد آزمون را افزایش دادند. فرمولاسیون های 5 و 4 همچنین در مواجهه با قارچ oxysporum Fusarium بترتیب به میزان 66/51 و 33/43 درصد و در مقابل قارچ Lagenidium sp. بترتیب 33/58 و 33/48 درصدبقاء لاروهای میگو را افزایش دادند. در مجموع فرمولاسیون های 5 مشتمل بر هسته باسیلوسی فوق الذکر بعلاوه سویه های NT 12 و ST 85 بیشترین عملکرد را در کاهش تلفات لارو میگوی وانامی نشان داد. نتایج پروژه درون تنی بعدی نشان داد میزان گلوکز در همولنف به جز در تیمار 8 روندی کاهشی داشت به طوری‌‌که در تیمارهای 4 و 5 کمترین میزان گلوکز مشاهده شد (05/0>P). میزان تری گلیسیرید همولنف در تیمارهای 3، 4، 5، 7 و 8 کاهش معنیداری داشت (05/0>P). میزان کلسترول همولنف در تیمارهای 4 تا 8، نسبت به تیمار شاهد کاهش معنیداری داشت (05/0>P). تفاوت معنیداری در میزان پروتئین همولنف و تعداد سلول‌‌های ترشحی هپاتوپانکراس میان تیمارها مشاهده نشد (P > 0/05). تیمار 5 کمترین میزان آلبومین همولنف را در مقایسه با سایر تیمارها داشت. به‌علاوه، میزان آلبومین در تیمارهای 4، 7 و 8 کاهش معنیداری نسبت به تیمار شاهد داشت (P < 0/05). تعداد کل هموسیت‌‌ها و سلول‌‌های گرانولار بزرگ در تیمارهای 2 تا 6 افزایش معنیداری نسبت به تیمار شاهد داشت (P < 0/05). به‌علاوه بیشترین میزان سلول‌‌های هیالینی و نیمه گرانولار در تیمار 4 مشاهده شد (P < 0/05). افزایش معنیدار در بیان ژن لیزوزیم در تمام تیمارهای دریافت کننده پروبیوتیک نسبت به تیمار شاهد وجود داشت (P < 0/001). همچنین افزایش معنیدار در بیان ژن کراستین در تیمارهای 2، 3، 5، 7 و 8 مشاهده شد (P < 0/001). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد تغذیه با کنسرسیوم پروبیوتیک تیمارهای 5 و 6 (حاوی هسته باسیلوسی و سویه های B 1083 و (NT 107 شاخص‌های ایمنی و غذایی سنجش شده را بهبود داد. نتایج سومین پروژه درون تنی نشان داد غلظت آمونیاک، نیتریت و نیترات در آب مخازن دریافت کننده پروبیوتیک بویژه تیمارها 7و 8 کاهش معناداری نسبت به تیمار شاهد داشت (05/0>P)، درصورتی که غلظت فسفات تغییر معناداری نشان نداد(05/0<P). میزان تجمع مواد دفعی تیمارهای 2 ،4 ،5 و 8 نسبت به شاهد کمتر بود(05/0>P). میانگین فراوانی باکتریهای هتروتروف در آب مخازن دریافت کننده پروبیوتیک در محدوده×105 CFU/ml 13/1 در تیمار 1 تا×105 CFU/ml 7/46 در تیمار 8 متغیر بود. میزان فراوانی باکتریهای جنس ویبریو در تیمارهای مختلف از 38 درصد در تیمار شاهد تا 15 درصد در تیمار5 ;کاهش یافت. در مجموع کنسرسیوم پروبیوتیک شماره 8 متشکل از هسته باسیلوسی و سویه های Vir. salarius . NT 12 و Ps. celer . NT 72 عملکرد مناسبی در بهبود کیفیت آب، کاهش میزان مواد ته نشین شده و اصلاح فلور میکروبی آب مخازن نشان داد. نتایج پروژه چهارم از مطالعات درون تنی نشان داد میانگین وزن میگو در روز ۱۵ پس از ذخیره سازی و پایان دوره آزمایش در تیمارهای ۲ و ۵ به ترتیب ۸۸/۴ و ۸۷/۴ گرم نسبت به سایر تیمارها و شاهد (۲۷/۴ گرم) اختلاف معنیداری را نشان داد (p<0/05). همچنین میانگین طول نهایی میگو وانامی در تیمار ۵ (۳۲/۹ سانتی‌متر) نسبت به سایر تیمارها و شاهد (۵۴/۸ سانتی‌متر) اختلاف معنیدار داشت (p<0/05). نتایج درصد بازماندگی میگوی وانامی نشان داد در تیمارهای ۲، 5 و ۷ به ترتیب برابر با ۷۱، ۶۷ و ۶۹ درصد نسبت به سایر تیمارها و شاهد (۶۴٪) اختلاف معنیدار داشت (p<0/05) . همچنین ضريب تبديل غذايی (FCR) طی دوره پرورش میگو در تیمار تغذیه شده با فرمولاسیون کنسرسیوم پروبیوتیک 3 معادل 9/0 به میزان 2/0 نسبت به تیمار شاهد معادل۱۰/۱ بصورت معنی داری کاهش یافت (p<0/05). دستاورد این طرح منجر به تدوین دانش فنی طراحی و فرمولاسیون های مختلف کنسرسیوم پروبیوتیک گردید. چهار فراورده با فرمولاسیون های اختصاصی برای تقویت سیستم ایمنی میگو، بازدارندگی در مقابل عوامل شاخص بیماریزا، ارتقاء رشد و بازماندگی و کاهش FCR و بهبود کیفیت آب و رسوبات استخرهای پرورش میگو طراحی شد.