رسانه های ترویجی
مرکز تحقيقات ذخاير آبزيان آبهاي داخلي-گرگان - شنبه سی و یکم فروردین 1398 

دستورالعمل فنی محاسبه کمترین غلظت موثر(MIC) باکتری سودوموناس آئروژینوزا برساپرولگنیازیس تخم تاسماهی ایرانی درآزمایشگاه (کنترل زیستی)

دستورالعمل فنی محاسبه کمترین غلظت موثر(MIC) باکتری سودوموناس آئروژینوزا برساپرولگنیازیس تخم تاسماهی ایرانی درآزمایشگاه (کنترل زیستی)
نویسنده: عباسعلی آقایی مقدم، مریم قیاسی، رضا صفری، کامران عقیلی         بازدید: 454 مرتبه
در تكثير مصنوعي ماهیان خاویاری مشكلاتي وجود دارد كه از ميان آنها ميتوان به قارچ زدگي تخم ها بعنوان يكي از قديمي ترين مسائل بخش تكثير اشاره كرد. عفونت قارچي در تخم ها از عوامل اصلي كاهش تعداد تخم مي باشد. ازعوامل اصلي قارچ زدگي مي توان به ساپرولگنيا اشاره نمود. به همين دليل بهبود کیفیت تخم ها از برنامه هاي اساسي در كارگاههای تکثیر مي باشد جستجو و بکاربردن داروی مناسبی که ضمن کارایی مطلوب، دارای حداقل اثرات سمی باشد همواره در جهت مبارزه با بیماریهای قارچی ازاهمیت بالایی برخورداراست. این مسئله بویژه در ماهیان خاویاری از جمله تاس ماهی ایرانی که دارای ارزش اقتصادی واعتبار جهانی ومنطقه ای است اهمیت مضاعفی دارد. امروزه جهان به سمت كاهش هر چه بيشتراستفاده ازمواد شيميايي رفته و تلاش مي كند روش هاي ديگري كه داراي كارايي بيشتر، سالم تر و با كمترين اثرات زيست محيطي مي باشد را جايگزين روشهاي موجود نمايد. به همين دليل بحث جديدي بنام بيوكنترل كمكم جاي خود را در كشاورزي وآبزي پروري باز كرده و جايگزين روشهاي معمول شده است. روش کار: برای اینکه یک باکتری مورد استفاده جهت کنترل زیستی قرارگیرد، ابتدا بایددرآزمایشگاه کمترین غلظت موثر آن محاسبه شده و سپس براساس محاسبه غلظت های موثر در مزرعه مورد استفاده قرارگیرد. مراحل فعالیت بترتیب درزیر آورده شده است. روش نمونه برداری: آماده سازی ظروف جهت تهیه نمونه: برای این کار از ظروف درب دار با قابلیت اتوکلاو شدن و به حجم 50سی سی استفاده نمایید. ابتدا 25 قطره آب مقطر به هر ظرف اضافه کرده و سپس 30 قطره کلرامفنیکل 5/0در صد (جهت جلوگیری از رشد باکتر ی) به ظرف اضافه کنید. ظروف را در اتوکلاو گذاشته و محلول را استریل نمایید. پس از استریلیزاسیون، محلول جهت نمونه برداری آماده است. استرلیزاسیون به این جهت است که در محیط آبی هیچ آلودگی موجود نباشد و تا جای ممکن از آلودگی های جانبی جلوگیری گردد نمونه برداری از قارچ در داخل تراف انکوباتور انواع مختلفی از تخم ها مشاهده می شود ازجمله تخم های سالم، لقاح نیافته، پلی اسپرمی، قارچ زده کامل که بشکل توپی درآمده و تازه قارچ زده. برای نمونه برداری باید از تخمهای تازه قارچ زده نمونه برداری نمایید زیراتخم¬های تازه قارچ زده ازاین نظر مناسبندکه احتمال غلبه چندین قارچ کمتر است و خالص سازی راحت تر انجام می گیرد. لازم به یادآوری است در انتخاب نمونه ها باید دقت شود تا هیچ ماده ضد قارچی در هچری استفاده نشده باشد. پس از تکمیل هر ظرف درب آنها را به خوبی بسته و به آزمایشگاه برسانید. کار در آزمایشگاه آماده سازی نمونه ها نمونه ها راپس از انتقال به آزمایشگاه به مدت 24 ساعت در انکوباتور(گرمخانه ) قراردهید. دمای گرمخانه برمبنای محیط طبیعی رشد قارچ یعنی آب سالن انکوباسیون درزمان نمونه برداری تعیین می شود آماده سازی محیط کشت برای رشد قارچ ساپرولگنیا از محیط کشت YGCکه محیط کشت اختصاصی رشد ساپرولگیناست استفاده نمایید. طبق دستورالعمل درج شده درروی قوطی محیط کشت(مقدار 40 گرم در لیتر) ابتدا 500 سی سی آب مقطر را در یک ارلن یک لیتری ریخته و 20 گرم محیط کشت به آن اضافه نمایید و سپس ارلن را روی سه پایه گاز قرار داده و در حالی که به آرامی حرارت می دهید بطور دائم آن را هم بزنید(تامحیط کشت شما ته نگیرند). پس از حدود 20 دقیقه، محلول شروع به شفاف شدن کرده و آرام آرام شروع به جوشیدن می کند. در این هنگام باید ارلن را برای جلوگیری از سر رفتن از روی گاز بردارید.سپس درب ارلن را با یک قطعه فویل آلومینیوم پوشانده و دورآن را با چسب کاغذی بسته و یک تکه چسب اتوکلاو هم جهت حصول اطمینان از استریل شدن ظرف به آن بچسبانید. ظرف را درون اتوکلاو قرار داده تا استریل شود. پس از استریل شدن محیط کشت، ارلن را در گوشه ای قرار داده تا کمی سردتر شود ولی نباید خیلی خنک شود چون شروع به سفت شدن می کند و به اصطلاح می بندد و خاصیت مایع و سیالیت خود را ازدست می دهد. آماده سازی پلیت ها پلیت های مورد استفاده رااز نوع 8 سانتی متری یک بار مصرف استریل انتخاب نمایید. آنها را در کنار هم چیده و تا یک سوم آنها را ازمحیط کشت پر کرده و درب آنها را بسته به کناری گذاشته تاخنک شوند. سپس آنهارادر یخچال بگذارید. باید دقت کنیدکه پلیت ها باید پشت و رو قرار داده شوند تا عرق و آب درب پلیت روی محیط کشت نریزد آماده سازی نمونه ها جهت کشت اولیه ابتدا محتویات هر ظرف نمونه را در پلیت ریخته ومایع اضافه آنرا دور بریزید. سپس هر نمونه تخم را به آرامی ترکانده و محتویات آن را تخلیه نمایید. چند بارآنها را با آب مقطر استریل شسته تا خوب از مواد اضافی پاک شوند.اینک نمونه ها برای کشت در محیط کشت آماده است کشت اولیه برای این کار ابتدا تعداد 5 پوسته تخم قارچ زده را در هر پلیت بصورت دایره ای کشت دهید. بدین طریق که ابتدا اسکالپل را در الکل 70 قرار داده و سپس روی آتش گرفته تا سرخ شود. تیغ را به کنار محیط کشت فروبرده تا سرد شده و سپس یکی یکی پوسته تخم های قارچ زده را در محیط کشت بکارید بدین طریق که همزمان با قرار دادن قارچ روی محیط یک شکاف هم در روی محیط ایجاد کرده و سعی نمایید کمی ازپوسته تخم در محیط فرو رود. پس از کشت 4 تا5 پوسته تخم در پلیت را ببندید. لازم به ذکر است که پس از کشت هر پلیت وقبل از کشت بعدی، اسکالپل و نوک پیپت پاستوررا باید استریل نمایید. پس از پایان کشت، پشت هر پلیت نام و تاریخ کشت رابنویسید. درپایان پلیت هارا در انکوباتوربا دمای 18 درجه جهت رشد قارچ قراردهید کشت مجددجهت خالص سازی پس از رشدکامل قارچ در پلیت ها، کشت های آلوده و ناخالص را جدانمایید و کشت های خالص را جهت کشت مجدد برای خالص سازی انتخاب کنید. نمونه برداری باید ازحاشیه کشت انجام شود تا حد الامکان کشت خالص باشد. یک برش مستطیل یا دایره ای شکل در حاشیه کشت ایجاد کرده و سپس قارچ را مثل یک لایه از محیط کشت جدا نمایید و آن را به محیط کشت جدید اضافه کنید یعنی روی محیط کشت قرار داده و با ایجاد یک برش کوچک در سطح محیط کشت، کناره لایه قارچ را درون محیط کشت کاشته و درب پلیت را ببندید. درکشت جدید در هر پلیت فقط یک قطعه قارچ کشت دهید. معمولاً قارچ ها پس از 3 تا 5 روز بطورکامل بالا آمده و آماده نمونه برداری مجدد می شوند. این روش خالص سازی را دو باردیگر تکرارکرده تا از خالص بودن قارچ بدست آمده مطمئن شوید. کشت خالص خود را دریخچال گذاشته تا برای کشت نهایی جهت مواجهه با باکتری آماده شود. جهت مواجهه نهایی باید از قارچ تازه کشت شده استفاده نمود و این کشت خالص، ذخیره مناسبی جهت کشت نهایی می باشد. آماده سازی محیط کشت جهت رشد باکتری: جهت در معرض قرار دادن باکتری با قارچ مقدار 500 سی سی مجیط  آماده نمایید و محیط کشت ها راپس از استریل، در پلیت های 8 سانتی متری ریخته و در یخچال قراردهید (MIC)
ابتدا محیط کشت های SDA  باکتری هارادرغلظت های مختلف درسه تکرار بصورت خطی درآنها کشت دهید و پس از 24 ساعت در مرکز هر پلیت یک قطعه قارچ قرارداده و روی پلیت را بپوشانید. 3 کشت کنترل باکتری و 3 کشت کنترل قارچ نیز آماده نمایید، یعنی در 3 پلیت فقط باکتری و در3 پلیت فقط قارچ کشت دهید. پلیت ها را در گرمخانه با دمای 18 درجه سانتی گراد قراردهید. تعیین کمترین و بیشترین غلظت موثرمی تواند در تعیین غلظت نهایی مورد استفاده در مزارع پرورش و یا هچری ها کمک نماید. هر روز کشت ها رامورد بررسی قراردهید وقطرپرگنه ها¬ی قارچ تشکیل شده را اندازه گیری و ثبت نمایید. آزمایش را تا آنجا ادامه دهید که پرگنه قارچ در کمترین غلظت قطرپلیت را کاملا بپوشاند. تمام داده ها را بطور روزانه ثبت نمایید.
میزان رشد پرگنه قارچ درهرغلظت نشاندهنده قدرت کنترل رشد قارچ توسط باکتری درآن غلظت مشخص می باشد شمانیز می توانید با این آزمایش
مقدار غلظت موثر را روی تخم های ماهیان مورد نظر خود بدست آورید
بدینوسیله از کلیه همکارانی که در انجام این تحقیق ما را یاری نمودند کمال سپاسگزاری را داریم
.